پایان نامه ارشد:کاربرد نشانگر مولکولی میکروستالیت ISSR در تنوع ژنتیکی توده‌های زنبور عسل Apis mellifera L. برخی از نقاط ایران

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :حشره شناسی

عنوان : کاربرد نشانگر مولکولی میکروستالیت ISSR در تنوع ژنتیکی توده‌های زنبور عسل Apis mellifera L.  برخی از نقاط ایران

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد جهرم

گروه حشره شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه­ی کارشناسی ارشد  «M.Sc.»

 

عنوان:

کاربرد نشانگر مولکولی میکروستالیت ISSR در تنوع ژنتیکی توده‌های زنبور عسل Apis mellifera L.  برخی از نقاط ایران

استاد راهنما:

دکتر ابوفاضل دوستی

استاد مشاور:

دکتر روح الله رجبی

تابستان  1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

چکیده————————————————————————————————————— 1

فصل اول

مقدمه————————————————————————————————————— 2

فصل دوم

بررسی و مرور منابع————————————————————————————————- 5

2-1- تاریخچه زنبور عسل و پرورش آن در جهان و ایران———————————————————- 6

2-2- ارزش اقتصادی زنبور عسل———————————————————————————– 8

2-3- جایگاه سیستماتیک زنبور عسل—————————————————————————– 9

2-4- اصلاح نژاد در زنبور عسل———————————————————————————– 10

2-5- ژنوم زنبور عسل——————————————————————————————— 12

2-6- تعریف نشانگر———————————————————————————————– 13

2-6-1- نشانگرهای مرفولوژیک———————————————————————————- 13

2-6-1-1- نشانگرهای مرفولوژیک و زنبور عسل—————————————————————- 14

2-6-2- نشانگرهای مولکولی————————————————————————————- 16

2-7- نشانگرهای مولکولی و حشرات—————————————————————————– 17

2-8- کاربرد اصلی نشانگرهای مولکولی در مطالعات اکولوژیکی حشرات—————————————– 18

2-8-1- برهم‌کنش حشرات و گیاهان میزبان——————————————————————— 19

2-8-2- برهم کنش حشرات و پاتوژن‌ها————————————————————————– 21

2-8-3- مقاوت به حشره‌کش‌ها———————————————————————————– 22

2-8-4- روابط شکار- شکارگر- پارازیتوئید———————————————————————- 23

2-8-5- سیستماتیک مولکولی———————————————————————————– 24

2-8-6- حشرات تراریخته—————————————————————————————- 25

2-9- میکروستلایت‌ها یا توالی‌های ساده تکرار شونده———————————————————– 26

2-10- نشانگر ISSR و کاربرد آن در مطالعات گیاهی و جانوری————————————————– 30

2-11- منابع تغییرات و چند شکلی—————————————————————————— 31

2-11-1- نمونه DNA——————————————————————————————— 32

2-11-2- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:——————————————————————— 32

2-11-3- روش کشف——————————————————————————————— 33

2-12- کاربردهای تکنیک ISSR———————————————————————————- 34

2-12-1- انگشت‌نگاری ژنتیکی———————————————————————————- 34

2-12-2- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی———————————————————————- 34

2-12-3- نقشه‌یابی ژنتیکی————————————————————————————– 34

2-12-4- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)——————————————————— 35

2-12-5- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی—————————————————————- 35

2-13- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی————————————————————– 36

2-14- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی——————————————————————– 37

2-15- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز—————————————————- 38

فصل سوم

مواد و روش‌ها—————————————————————————————————— 40

3-1- جمع آوری نمونه‌ها—————————————————————————————— 41

3-2- استخراج DNA زنبور عسل——————————————————————————— 43

3-3- تعيين کیفیت DNA استخراج شده———————————————————————— 45

3-3-1- الکتروفورز DNA در ژل آگارز 1 درصد—————————————————————— 45

3-3-2- بررسي غلظت DNA استخراج شده——————————————————————— 46

3-3-3- رقيق سازي DNA استخراجي براي دستيابي به غلظت  ng/µl25————————————- 47

3-4- واکنش زنجيره‌ای پليمراز———————————————————————————– 47

3-5- الکتروفورز محصول PCR روي ژل آگارز——————————————————————– 49

3-6- نمره دهي باندهاي مشاهده شده روي آگارز نشانگر غالب ISSR——————————————- 50

3-7- ورود داده‌هاي حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل———————————————————— 51

3-8- اندازه گيري فواصل و تشابه‌هاي ژنتيکي——————————————————————– 54

3-9- روش هاي گروهبندي داده ها——————————————————————————- 55

3-10- تجزيه خوشه اي——————————————————————————————- 56

3-11- نيکويي برازش خوشه بندي يا ضريب کوفنتيک———————————————————- 56

3-12- تجزيه به مولفه هاي اصلي——————————————————————————— 57

3-13- آناليز داده‌های مولکولی———————————————————————————– 58

3-14- بررسی‌های مورفولوژیکی———————————————————————————- 58

3-15- تجزیه به مؤلفه اصلی————————————————————————————– 60

3-16- آناليز داده‌های مورفولوژیکی—————————————————————————— 61

فصل چهارم

نتايج————————————————————————————————————— 62

بررسی تنوع مرفولوژیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه——————————————————- 63

4-2- نتایج مربوط به هفت صفت ظاهری اندازه‌گیری شده روی زنبوران عسل پنج استان ایران—————– 63

4-3- همبستگی خصوصیات ظاهری زنبور عسل پنج استان ایران———————————————– 64

4-4- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران————————————- 65

4-5- تجزيه خوشه‌اي و تجزيه به مولفه‌هاي اصلي بر اساس داده‌هاي مرفومتریک——————————- 66

4-6- بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبور عسل مورد مطالعه—————————————————– 67

4-7- تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه——————————— 72

4-8- تعداد باندهای تولیدی در هر نژاد زنبور عسل————————————————————— 72

4-9- تعداد باندهای تولید هر آغازگر و کارایی آنها در تکثیر—————————————————– 73

4-10- ماتریس‌های شباهت و تفاوت بین زنبورهای پنج استان مختلف ایران———————————– 74

4-11- تجزيه خوشه‌اي و تجزيه به مولفه‌هاي اصلي بر اساس داده‌هاي مولكولي——————————— 74

4-12- بررسی شاخص نشانگری و قدرت تمایز آغازگرهای مورد مطالعه روی زنبور عسل———————– 76

4-13- تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل در زنبورهای مورد مطالعه—————– 77

4-14- دندوگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفومتریک———————————————- 78

فصل پنجم

بحث و نتیجه‌گیری————————————————————————————————- 79

چگونگی کاربرد و آنالیز نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی زنبور عسل———————————————— 81

بررسی تنوع ژنتیکی نژادهای زنبورعسل مورد مطالعه———————————————————— 87

پیشنهادات:——————————————————————————————————– 90

منابع————————————————————————————————————— 91

فهرست جداول

جدول 2-1: نام‌های متفاوت و همنام تکنیک ISSR-PCR- 31

جدول3-1: مکان‌ و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل- 42

جدول 3-2 مواد واكنش، ‌حجم و غلظت نهايي اجزاي واكنش زنجيره پليمراز 48

جدول3-3: صفات مرفولوژیک اندازه‌گیری شده 59

جدول 4-1: میانگین هفت صفت مرفولوژیک زنبوران کارگر مورد مطالعه- 63

جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژیک زنبور عسل پنج استان ایران- 64

جدول 4-3: همبستگی بین صفات ظاهری اندازه‌گیری شده در زنبور عسل- 65

جدول 4-4: ضریب فاصله مرفولوژیکی  و تشابه مرفولوژیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل- 65

جدول 4-5: لیست آغازگرها، توالی آنها و چند شكلي مشاهده شده در نژادهای زنبور عسل- 68

جدول 4-6: تعداد باندهای تولیدی هر آغازگر برای زنبورهای استان‌های مورد مطالعه- 72

جدول 4-7: ضریب تشابه ژنتیکی و فاصله ژنتیکی بین پنج جمعیت زنبور عسل  بر اساس نشانگر ISSR- 74

جدول 4-8: میزان برخی شاخص‌های آغازگرهای مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتیکی زنبور عسل- 76

فهرست اشکال

شکل 2-1: نقاشی کشف شده از زنبورداری در والنسیای اسپانیا 6

شکل 2-2: طبقه بندی انواع نشانگرهای ژنتیکی- 17

شکل3-1: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل- 41

شکل3-2: نمایی از مکان‌های جمع آوری نمونه‌های زنبور عسل- 42

شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در اين آزمايشات– 43

شکل 3-4: دستگاه سانتريفيوژ مورد استفاده در اين آزمايشات– 44

شکل 3-5: بررسي کيفيت DNA استخراج شده ژنومي روي ژل آگارز 1 درصد- 46

شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعيين غلظت DNA- 47

شکل 3-7: برنامه واكنش زنجيره‌اي پليمراز 49

شکل 3-8: دستگاه‌هاي PCR مورد استفاده در اين آزمايشات– 49

شکل 3-9: تانک‌ الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در اين آزمايشات– 50

شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سيستم تصويربرداري از ژل آگارز 50

شکل 3-11: باندهاي موجود و نمره‌دهي لوکوس‌هاي موجود حاصل از تصويربرداري ژل‌هاي آگارز نشانگر ISSR- 51

شکل 3-12: ورود داده‌هاي حاصل از نمره‌دهي ژل‌هاي آگارز به نرم افزار اکسل جهت آناليز- 51

شکل 3-13: نمایی از بال جلویی زنبور عسل و صفات اندازه‌گیری شده 60

شکل 3-14: دستگاه استریومیکروسکوپ مجهز به دوربین مورد استفاده در آزمایشات– 60

شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابهCorr   66

شکل 4-2: مقایسه زنبورهای عسل مورد بررسی با استفاده از روش تجزیه به مولفه‌های اصلی- 67

شکل 4-3: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1  با استفاده از مارکر bp 50- 69

شکل 4-4: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-5: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 50- 70

شکل 4-6: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-7: تصاویر ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 50- 71

شکل 4-8: تعداد باندهای تولیدی در نژادهای زنبور عسل- 73

شکل 4-9: تعداد باندهای تولیدی آغازگرهای مورد استفاده 73

شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آنالیز خوشه ای بر اساس روش UPGMA با ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-11: پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مختصات اصلی به‌روش ماتریس تشابه Jaccard 75

شکل 4-12: تعداد کل جایگاه‌های ژنی و تعداد جایگاه‌های ژنی  چندشکل 77

شکل 4-13: دندروگرام اجماعی حاصل از داده‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی- 78

فهرست معادلات

معادله 3-1: محتوای اطلاعات چندشکلي نشانگر- 52

معادله 3-2: ميزان چندشکلي نشانگر- 52

معادله 3-3: ارزشمندی باندها 53

معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-5: ميانگين قدرت حل هر آغازگر- 53

معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر- 53

معادله 3-7: شاخص نشانگري- 54

معادله 3-8: ضريب تشابه جاکارد- 55


چکیده

نشانگر مولکولی ISSR به منظور جداسازی نژادهای زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهاي كارگر با استفاده از روش بهینه نمکی صورت گرفت و پس از سنجش کمی و کیفی DNA استخراج شده و رقیق سازی آن، مقادیر حاصل از باندهای بدست آمده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد نمره‌دهی و آنالیز صورت گرفت. نتایج نشان داد که باندهای آغازگرهاي مورد مطالعه شده در محدوده‌‌ي 150 جفت باز تا 1000 جفت باز قرار دارند و بیشترین تعداد باند مشاهده شده مربوط به آغازگر 1 و کمترین آنها مربوط به آغازگر 3 و 4 بوده است. آنالیز خوشه‌ای نژاد‌های مورد مطالعه آنها را در دو گروه اصلی قرار داد. در گروه اول فارس و در گروه دیگر که به دو زیر گروه تقسیم شده یکی شامل اصفهان و دیگری شامل مرکزی، خوزستان و کردستان، دو استان کردستان و خوزستان دارای بیشترین شباهت بودند. به نظر می‌رسد نشانگر ISSR بتواند به خوبی نژاد‌های زنبور عسل با منشاء مختلف را از هم جدا سازد.

واژه‌های کلیدی: نشانگر مولکولی، زنبور عسل، بهینه نمکی، تنوع ژنتيكي

 فصل اول

مقدمه

براساس آمار سازمان خواربار جهانی بیش از هفتاد میلیون کلنی زنبور عسل در جهان وجود دارد که محصولات تولیدی آنها در راستای تامین نیازهای غذایی، دارویی و بهداشتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. بعلاوه زنبور عسل با گرده افشانی گیاهان زراعی و باغی نقش بسیار مهمی در افزایش محصولات کشاورزی و پایداری محیط زیست ایفا می‌کند. در بین حشرات گرده افشان زنبور عسل بدلیل حمایت بشر، جمعیت بیشتر کلنی و جابجایی کلنی‌ها برای تولید محصول بیشتر و دامنه فعالیت وسیع‌تر، خصوصیات بیولوژیکی، رفتاری و مرفولوزیک خاص  بهترین نقش را ایفا می‌کند و از اهمیت بالاتری برخوردار است. منطقه‌ی انتشار طبیعی زنبور عسل در جهان محدوده‌ی وسیعی است که از شمال به جنوب کشور های اسکاندیناوی، از غرب به داکار، از جنوب به دماغه امیدنیک و از شرق به کوه‌های اورال، مشهد و عمان محدود می‌شود، البته این حشره توسط انسان به سایر نقاط جهان نیز منتقل شده است (طهماسبی و همکاران، 1378). از زمان آشنایی بشر با زنبور عسل تولیدات آن بویژه عسل همواره به عنوان یک ماده‌ی غذایی ایده‌آل مورد توجه بوده است. عسل در فرهنگ عامه به عنوان یکی از شفابخش‌ترین فراورده‌های غذایی مطرح است. بررسی‌ها نشان می‌دهد که محصولات کندو و از جمله عسل علاوه بر مغذی بودن‌، دارای اثرات درمانی نیز می‌باشد (توپچی و علمی، 1388). برای تولید بیشتر عسل نیاز به جمعیت‌های قوی می‌باشد و تولید جمعیت‌های قوی نیز در سایه‌ی مدیریت صحیح بر پایه‌ی دانش علمی ممکن می‌باشد. یکی از مسائلی که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتیجه تضعیف کلنی‌ها گردد، پدیده‌ی تلاقی‌های خویشاوندی می‌باشد که منجرب به افزایش هم‌خونی یا هموزیگوتی آلل‌های جنسی می‌گردد (Mayer, 1996).

تعیین وضعیت ژنتیکی موجودات زنده زیربنای اصلاح نژاد آنها در هر منطقه است برای تعیین این وضعیت و تفکیک توده‌های مختلف زنبور عسل در یک منطقه از روشهای مرفولوژیکی، تنوع پروتئین‌ها و DNA نگاری استفاده می‌شود (طهماسبی و همکاران، 1376). برخی از تفاوت‌های موجود در ردیف  DNAبین دو موجود ممکن است به صورت پروتئین‌هایی با اندازه‌های مختلف تجلی کنند که بروش‌های مختلف بیوشیمیایی قابل ثبت و رویت و مطالعه می‌گردند. این قبیل نشانگرها را نشانگرهای مولکولی در سطح پروتئین می‌نامند‌ که از آن جمله می‌توان به سیستم آیزوزایم/ آللوزیم اشاره کرد. اما دسته‌ی دیگر از تفاوت‌های موجود در سطح DNA هیچ تظاهری ندارند، نه صفت خاصی را کنترل می‌کنند و نه در ردیف اسیدهای آمینه پروتئین‌ها تاثیری برجای می‌گذارند. این دسته از تفاوت‌ها را می‌توان با روش‌های مختلف شناسایی، قابل دیدن و ردیابی کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. این نشانگرها که تقریباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزیه وتحلیل مستقیم DNA قابل ثبت هستند و بنابراین به آنها نشانگرهای مولکولی در سطح DNA گفته می‌شود. طي ساليان اخير شناسايي و بررسي تنوع ژنتيك در بين گونه‌هاي حشرات بر اساس نشانگر‌هاي مولكولي و روش‌هاي مبتني بر واكنش زنجيره‌اي پليمراز PCR بسيار متداول گشته است. ولي در كشور ما بررسي تنوع مولكولي در زمينه حشره شناسي بسيار كم انجام گرفته است. امروزه میکروساتلیت‌ها نقش مهمی در تعیین تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی جانوران و گیاهان و مخصوصاً حشرات ایفا می‌کنند. استفاده از نشانگر ISSR بیشتر جهت تنوع ژنتیکی گیاهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از این نشانگر جهت بررسی تنوع ژنتیکی راسته بالپولکداران به ویژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae ، راسته دوبالان و بال غشائیان در کانون توجه مجامع علمی قرار گرفته است(Luque, et al., 2002; Hundsdoerfer, et al., 2005; Radjab, et al., 2012).

تعداد صفحه : 120

قیمت : 14700 تومان

———–

——-

پشتیبانی سایت :               [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  --