دانلود پایان نامه ارشد:طراحي و استقرار روش جديد سم زدايي سريع از واكسن سياه سرفه

متن کامل پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : طراحي و استقرار روش جديد سم زدايي سريع از  واكسن سياه سرفه

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارويي

دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه زیست شناسی

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد ((M.Sc))

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

طراحي و استقرار روش جديد سم زدايي سريع از  واكسن سياه سرفه

 

استاد راهنما:

جناب آقاي دکتر عبدالرضا موحدی

 

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر اسماعیل اصلی

جناب آقاي دكتر حسين عطار

سال تحصيلي 92-1391

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                              صفحه

خلاصه فارسي ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 1

فصل اول: کلیات

1-1. بيان مسئله ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-2. تاریخچه بیماری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………………….. 4

1-3. باکتریولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………………………. 7

1-4. ترکیبات مهم باکتری سیاه سرفه …………………………………………………………………………………………………. 10

1-4-1. توکسین پرتوسیس…………………………………………………………………………………………………………………….. 10

1-4-2. فیلامنتوس هموگلوتینین (FHA)………………………………………………………………………………………….. 12

1-4-3. فیمبریه و آگلوتینين ها…………………………………………………………………………………………………………….. 13

1-4-4. پرتکتین………………………………………………………………………………………………………………………………………. 15

1-4-5. آدنیلات سیکلاز (ACT)…………………………………………………………………………………………………………. 16

1-4-6. تراکئال سایتو توکسین (TCT)………………………………………………………………………………………………. 17

1-4-7. توکسین حساس به حرارت……………………………………………………………………………………………………….. 18

1-4-8. BrKA………………………………………………………………………………………………………………………………………. 18

1-4-9. اندوتوکسین………………………………………………………………………………………………………………………………… 19

1-5. سويه هاي بوردتلا پرتوسيس ………………………………………………………………………………………………………… 19

1-6. اپيدميولوژي ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 20

1-6-1. وضعيت بيماري در ايران……………………………………………………………………………………………………………. 21

1-7. بیماری زایی سیاه سرفه  ………………………………………………………………………………………………………………. 21

1-8. علائم کلینیکی ………………………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-9. تشخیص بیماری …………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-1. تشخیص بالینی………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-9-2. علائم کلینیکی در نوزادان…………………………………………………………………………………………………………. 24

1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان………………………………………………………………………………………………….. 25

1-10. پاسخ ایمنی در برابر سیاه سرفه ………………………………………………………………………………………………… 26

1-10-1. پاسخ ایمنی همورال………………………………………………………………………………………………………………… 27

1-10-2. پاسخ ایمنی سلولی…………………………………………………………………………………………………………………. 28

1-11. روش های آزمایشگاهی تشخیص………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-1. کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………… 30

1-11-2. سرولوژی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 30

1-11-3. PCR …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 32

1-12. مدیریت بیماری…………………………………………………………………………………………………………………………….. 33

1-13. پیشگیری …………………………………………………………………………………………………………………………………….. 34

1-13-1. راهبردهای بالقوه در مهار بیماری سیاه سرفه در اوایل نوزادی……………………………………………. 35

1-13-1-1. واکسیناسیون بالغین و سالمندان……………………………………………………………………………………… 37

1-13-1-2. حفاظت غیرمستقیم نوزادان از طریق واکسیناسیون والدین………………………………………….. 37

1-13-1-3. ایمن سازی نوزادان و کودکان…………………………………………………………………………………………… 38

1-13-1-4. واکسیناسیون مادر در دوران بارداری……………………………………………………………………………….. 38

1-14. استراتژی های واکسن………………………………………………………………………………………………………………….. 39

1-14-1. واکسن غير سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………. 39

1-14-2. واکسن سلولی سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………. 40

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

2-1. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………………. 42

2-1-1. تعريف تست كنترل سميت زدايي (MWGT) ……………………………………………………………………. 43

2-1-2. تعريف تست حفاظتي داخل مغزي موش (تست توانمندي Potency test) …………………… 44

2-1-3. ابداع روش کشت……………………………………………………………………………………………………………………….. 44

2-1-4. جداسازی سلول باکتری از کشت……………………………………………………………………………………………… 45

2-2. تاریخچه تولید واکسن سیاه سرفه در انستیتو رازی…………………………………………………………………….. 46

2-3. غیرفعال سازی سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 47

2-3-1. استفاده از فرمالین و تیومرسال برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه…………. 47

2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهید برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………. 49

2-3-3. استفاده از حرارت برای سمیت زدایی سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه……………………………….. 49

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1. تجهیزات و وسایل ………………………………………………………………………………………………………………………….. 51

3-2. مواد و محیط ها ……………………………………………………………………………………………………………………………… 52

3-2-1. محیط کشت آگار بورده ژانگو……………………………………………………………………………………………………. 52

3-2-2. محیط کشت وِروِی…………………………………………………………………………………………………………………….. 53

3-2-3. محیط B2…………………………………………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-4. محیط کشت سویابین کازئین…………………………………………………………………………………………………… 54

3-2-5. محیط تیوگلیکولات براث………………………………………………………………………………………………………….. 55

3-3. روش کار …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 56

3-3-1. انتخاب سویه های بوردتلا پرتوسیس……………………………………………………………………………………….. 56

3-3-1-1. لیوفیلیزه کردن……………………………………………………………………………………………………………………… 56

3-3-2. کشت باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………………………………….. 56

3-3-2-1. کشت تجدید حیات روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………. 56

3-3-2-2. کشت بذر روی محیط وِروِي………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه…………………………………………………………….. 57

3-3-2-3-1. استریلیزاسیون فرمانتور…………………………………………………………………………………………………… 57

3-3-2-3-2. آماده سازی و بهینه سازی محیط کشت فرمانتوري……………………………………………………… 58

3-3-2-3-3. تلقیح بذر به محیط کشت در فرمانتور…………………………………………………………………………… 58

3-3-3. جداسازی باکتری سیاه سرفه از محیط کشت…………………………………………………………………………. 59

3-3-3-1. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سانتریفوژ…………………………………………………………………. 59

3-3-3-2. جداسازی سلول باکتری با استفاده از سیستم میکرو فیلتراسیون……………………………………. 59

3-3-4. غیرفعال سازی سلول باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………………… 60

3-3-5. سمیت زدایی سوسپانسیون باکتری سیاه سرفه………………………………………………………………………. 60

3-3-5-1. سمیت زدایی با استفاده از فرمالین……………………………………………………………………………………… 61

3-3-5-2. سمیت زدایی با استفاده از تیومرسال………………………………………………………………………………….. 61

3-3-6. تست های کنترلی سوسپانسیون سیاه سرفه…………………………………………………………………………… 61

3-3-6-1. تست استریلیتي……………………………………………………………………………………………………………………. 61

3-3-6-2. تست کنترل غیرفعال بودن باكتري…………………………………………………………………………………….. 62

3-3-6-3. تست کنترل سمیت زدایی (MWGT) …………………………………………………………………………… 62

3-3-6-4. تست توانمندي……………………………………………………………………………………………………………………… 62

فصل چهارم: نتایج

4-1. تجدید حیات بذر بر روی محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………… 64

4-2. تهیه بذر در محیط وِروِی……………………………………………………………………………………………………………….. 64

4-3. کشت فرمانتوری باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………………………………… 64

4-4. جداسازی باکتری سیاه سرفه از کشت………………………………………………………………………………………….. 67

4-5. غیرفعال سازی و سمیت زدایی باکتری سیاه سرفه برای تولید واکسن……………………………………… 69

4-5-1. سمیت زدایی با فرمالین…………………………………………………………………………………………………………….. 69

4-5-2. سمیت زدایی با تیومرسال…………………………………………………………………………………………………………. 69

4-6. آزمایش های کنترلی سوسپانسیون های سیاه سرفه……………………………………………………………………. 69

4-7. نتایج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سلولی سیاه سرفه

سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال…………………………………………………………………………………………….. 72

4-8. آزمون MWG و مقایسه تغییرات اوزان موش ها……………………………………………………………………….. 75

4-9. تست توانمندي واکسن های آزمایشی سیاه سرفه……………………………………………………………………….. 80

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

بحث ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 83

نتيجه گيري و پیشنهادات ………………………………………………………………………………………………………………………. 88

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 89

خلاصه انگلیسی ……………………………………………………………………………………………………………………………………. 97

ضمايم ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 98

 فهرست جداول

عنوان                                                                                                                             صفحه

جدول1-1. آنتی ژن های مختلف سیاه سرفه…………………………………………………………………………………………… 9

جدول1-2. علائم کلینیکی بیماری سیاه سرفه……………………………………………………………………………………… 26

جدول1-3. آنتی بیوتیک های مورد استفاده در درمان سیاه سرفه حاد و رژیم مصرف آن……………….. 34

جدول1-4. واکسیناسیون سیاه سرفه در کشورهای مختلف…………………………………………………………………. 36

جدول2-1. ترکیب محیط لیستر و B2  بر اساس گرم در لیتر…………………………………………………………….. 45

جدول3-1. لیست دستگاه ها و تجهیزات مورد استفاده………………………………………………………………………… 51

جدول3-2. لیست مواد و محیط های مورد استفاده در تولید واکسن سیاه سرفه………………………………. 52

جدول3-3. ترکیبات محیط بورده ژانگو………………………………………………………………………………………………….. 53

جدول3-4. ترکیبات محیط کشت وِروِی………………………………………………………………………………………………… 53

جدول3-5. ترکیبات محیط کشت B2…………………………………………………………………………………………………… 54

جدول3-6. ترکیبات محیط کشت سویابین کازئین………………………………………………………………………………. 55

جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتري سياه سرفه براي توليد واكسن…………………………………………….. 68

جدول4-2. نتايج حاصل از انجام آزمايش هاي غيرفعال سازي و استريليتي سوسپانسيون هاي باكتري  سياه سرفه سميت  زدايي شده با فرمالين……………………………………………………………………………………………………………………………….. 70

جدول4-3. نتايج حاصل از انجام آزمايش هاي غيرفعال سازي و استريليتي سوسپانسيون هاي باكتري  سياه سرفه سميت  زدايي شده با تيومرسال…………………………………………………………………………………………………………………………….. 71

جدول4-4. نتایج حاصل از کنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین و تیومرسال با استفاده از آزمون MWG………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

جدول4-5. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با فرمالین با استفاده از آزمون MWG   76

جدول4-6. نتایج كنترل توکسیسیتی سوسپانسیون های سمیت زدایی شده با تیومرسال با استفاده از آزمون MWG 77

جدول4-7. نتایج حاصل از انجام تست توانمندي برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با فرمالین (FDV)     80

جدول4-8. نتایج حاصل از انجام تست توانمندي برای شش واکسن تجربی سمیت زدایی شده با تیومرسال (TDV)  81

 فهرست نمودارها

عنوان                                                                                                                صفحه

 

نمودار1-1. مقایسه تعداد افراد زیر یک سال ایمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال

2000 تا 2010 ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

نمودار4-1. تغییرات pH کشت سویه 134 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-2. تغییرات pH کشت سویه 509 از باکتری سیاه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور….. 65

نمودار4-3. مقايسه­ي ميانگين جذب نوري در طول موج هاي530 و590 در مقدار جرم  باكتري در هنگام برداشت در بچ هاي مختلف سويه 134 و 509……………………………………………………………………………………………………………… 66

نمودار4-4. مقدار غلظت نهايي باكتري سياه سرفه (cell109×1) سويه 134 در پايان دوره كشت در هنگام برداشت   66

نمودار4-5. مقدار غلظت نهايي باكتري سياه سرفه (cell109×1) سويه 509 در پايان دوره كشت در هنگام برداشت   67

نمودار4-6. مقايسه دوره ي سميت زدايي سوسپانسيون هاي سلولي سياه سرفه  سويه 134  توسط  فرمالين و تيومرسال با استفاده از تست MWG ……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-7. مقايسه دوره ي سميت زدايي سوسپانسيون هاي سلولي  سياه سرفه در سويه 509 توسط فرمالين و تيومرسال با استفاده از تست  MWG……………………………………………………………………………………………………………………….. 74

نمودار4-8. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با واكسن تجربي سميت زدايي شده با فرمالين نسبت به تيومرسال در سويه 134……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-9. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با واكسن تجربي سميت زدايي شده با فرمالين

نسبت به تيومرسال در سويه  509………………………………………………………………………………………………………. 78

نمودار4-10. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با سوسپانسيون هاي سميت زدايي شده سويه 134 با تيومرسال و فرمالين نسبت به موش هاي گروه كنترل……………………………………………………………………………………………….. 79

نمودار4-11. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده توسط واكسن سياه سرفه حاصل از سميت­

زدایي با فرمالين وتيومرسال در سميت زدایي درسوش509 توسط تست MWG ……………………….. 79

نمودار4-12. مقايسه نتايج حاصل از توانمندي واكسن هاي تجربي سميت زدايي شده با فرمالين (FDV) با واكسن هاي تجربي سميت زدايي شده با تيومرسال((TDV …………………………………………………………………………………… 81

       فهرست اشكال

عنوان                                                                                                                               صفحه

شكل1-1. كوكوباسيل سياه سرفه……………………………………………………………………………………………………………… 7

شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسيس به سلول هاي پوشش مژه دار مجاري تنفسي……………………………….. 9

شكل1-3. شماي شماتيك از پرتوسيس توكسين…………………………………………………………………………………. 11

شكل3-1. فرمانتور استفاده شده براي كشت سياه سرفه……………………………………………………………………… 58

خلاصه فارسی

سياه سرفه بيماري عفوني باكتريال دستگاه تنفس است كه عامل آن بوردتلا پرتوسيس از دسته باكتري هاي گرم منفي مي باشد.  در اين مطالعه شش بچ از سويه هاي 134 و 509 باكتري سياه سرفه تهيه شده و مورد مقايسه قرار گرفتند. از دو روش فيزيكي سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون براي جداسازي سلول باكتري از محيط كشت استفاده گرديد. سپس سلول­هاي جداسازي شده باكتري درPBS  خنك و استريل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نام­هاي سوسپانسيون سميت­زدايي با فرمالين (FD) و سوسپانسيون سميت زدايي با تيومرسال (TD) تقسيم شدند. به سوسپانسيون هايFD  بعد از غيرفعال سازي در حرارت 56 درجه سانتيگراد بمدت 10 دقيقهmM  10فرمالين (7/37 %) اضافه گرديد و به سوسپانسيون هايTD  در شرايط مشابه، بعد از غیرفعال سازی با حرارت، w/v 01/0 % تيومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسيون در دماي 8-4 درجه سانتيگراد براي سميت زدايي انكوبه شدند. در روزهاي 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسيون نمونه برداري شد تا سميت آنها با انجام تست افزايش وزن موش (MWG) مورد ارزيابي قرار گيرد. در نهايت نيز شش واكسن آزمايشي FD وTD  از مخلوط كردن غلظت هاي مشابه دو سويه 134 و 509 تهيه گرديد تا بتوان توانمندي اين واكسن ها را در تست حفاظتي موش با تستKendrick  ارزيابي نمود. نتايج حاكي از آن بود كه روش سميت زدايي با فرمالين با ميانگين دوره  6/26 روز در مقايسه با روش سميت زدايي با تيومرسال با ميانگين دوره 195 روز، روش كوتاهتري از نظر زماني براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه است. توانمندي واكسن تجربي حاصل از سميت زدايي با فرمالين با ميانگين 9/5 از واكسن تجربي حاصل از سميت زدايي با تيومرسال با ميانگين 95/5 قدري كاهش را نشان داده است. براساس نتايج حاصل، فرمالين با كاهش دوره سميت زدايي در درجه حرارت 8-4 درجه سانتيگراد بميزان 5/7 برابر بسيار مناسب تر از تيومرسال بود. اگرچه توانمندي واكسن حاصل از روش سميت زدايي با تيومرسال حدود 05/0 واحد بيشتر از واكسن حاصل از سميت زدايي با فرمالين است ولي تفاوت از نظر آماري ناچيز بود.

کلیدواژه­ها: بوردتلاپرتوسیس- سمیت زدایی- تیومرسال- فرمالین- تست افزایش وزن موش (MWG) – تست حفاظتی موش با تست kendrik

فصل اول

کلیات

1-1. بیان مسأله

بيماري سياه سرفه يك عفونت تنفسي بوده كه توسط باكتري بوردتلا پرتوسيس[1] از دسته باكتري­هاي گرم منفي ايجاد مي شود. نشانه عمده بيماري سرفه هايي است كه ممكن است تا چند هفته نيز طول بكشد كه مشخصه آن پاروكسيزمال[2] شديد با سرفه هاي ناگهاني است كه اغلب خاتمه آن با يك دم همراه مي باشد. بيماري در نوزادان و اطفال بيشتر رخ مي دهد (2و18).

در تولید واکسن سلولی سیاه سرفه به روش سنتی و جاری آن در مؤسسه واكسن و سرم سازي رازي جدا سازي باكتري به روش ترسيب با اسيدكلريدريك انجام گرفته و سپس به منظور سميت زدايي[3] توکسین های موجود در سوسپانسیون سلولی باکتری سیاه سرفه از تيومرسال و انکوباسیون درسردخانه به مدت طولانی 12-9 ماه استفاده می گردد. جدا سازي جرم باكتري با استفاده از اسيد از يك سو و فرآیند طولانی     سميت زدايي با مرتيولات از سوی دیگر منجر به کاهش توانمندی واکسن می گردد. لذا در این پروژه با جایگزینی روش هاي جدا سازي فيزيكي باكتري از محيط كشت بجاي روش شيميايي از يك سو آسيب­هاي احتمالي به ساختار سلولي باكتري را كاهش داده و از سوي ديگر با استفاده از فرمالین بجای تیومرسال زمان مورد نیاز برای سميت زدايي سوسپانسیون سلولی سیاه سرفه به حداقل تقليل يافت تا ضمن کاهش دوره فرآوری   آنتی ژن بتوان فرآورده ای با کیفیت مناسب تر را تولید نمود (4).

تعداد صفحه : 112

قیمت : 14700 تومان

———–

——-

پشتیبانی سایت :               serderehi@gmail.com

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

--  --